FoxM1在非小细胞肺癌转移和靶向治疗耐药中的作用及机制研究

【摘要】第一部分FoxM1促进肺癌细胞转移、影响预后的临床研究[摘要]目的：通过对175例临床非小细胞肺癌患者病理组织蜡块进行切片、免疫组化染色,观察FoxM1与非小细胞肺癌转移及预后的关系。方法：收集175例非小细胞肺癌患者病理组织蜡块,免疫组化染色方法观察FoxM1表达强度。表达强度分为4个等级：(-)为阴性,(+)为弱阳性,(++)为中等阳性,(+++)为强阳性。临床随访、翻阅病史等方法收集患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移情况、TNM分级以及分化情况等临床资料。Kaplan-Meier生存分析用于分析FoxM1表达与生存预后关系；Cox回归模型评估FoxM1是否为影响预后的独立因素；Fisher’sexacttest评价FoxM1与各临床预后指标之间的关系。结果：非小细胞肺癌病理组织切片中FoxM1的表达越高,患者病理分化越低(P=0.052),TNM分级越高(p<0.001)、越容易出现淋巴结转移(p<0.001)、肿瘤分级越高(p<0.001)、临床预后越差(p<0.001)。在平衡其它临床预后指标作用后,多因素分析显示FoxM1表达越高,患者死亡风险越大(hazardratio,1.942；95%CI,1.051-3.589)。结论：FoxM1表达与临床多项预后指标之间密切相关。肺癌组织中FoxM1的表达可以作为预测非小细胞肺癌患者预后的生物标志物；FoxM1可能是通过促进肺癌转移影响预后的。第二部分FoxM1促进肺癌细胞转移的体内外实验及机制研究[摘要]目的：建立FoxM1稳定高表达和稳定干扰肺癌细胞株,观察不同表达水平的FoxM1对肺癌细胞侵袭、迁移作用的影响,利用稳定高表达FoxM1的PC-9肺癌细胞株,构建裸鼠肺转移模型,探讨FoxM1在肺癌发生和进展中的可能作用。方法：构建FoxM1质粒、通过慢病毒包装、感染细胞,建立稳定高表达FoxM1的H292(H292FoxM1)和PC-9(PC-9FoxM1)肺癌细胞株及相对应的空载体质粒稳定转染细胞株(对照细胞株)。同时,构建shRNA慢病毒表达载体,感染细胞,建立稳定干扰FoxM1的H1299(H1299shRNA-FoxM1)和PC-9(PC-9shRNA-FoxM1)肺癌细胞株及相对应的无关序列载体稳定转染细胞株(对照细胞株)。应用real-timePCR和westernblot及免疫细胞荧光等方法检测各细胞株中FoxM1的表达。细胞迁移、侵袭等体外实验,观察不同FoxM1表达水平时肺癌细胞体外迁移和侵袭特性的改变。建立在体肺癌转移模型,用免疫组化、小动物成像技术等检测FoxM1过表达PC-9细胞在裸鼠体内的转移能力,分析比较高表达FoxM1细胞株与对照细胞株之间的形态差异,以及上皮-间叶细胞转化(Epithelial-MesenchymalTransition,EMT)相关标志物E-cadherin、ZO-1、N-cadherin和Vimentin等的表达差异。结果：各目的(H292FoxM1、PC-9FoxM1和H1299shRNA-FoxM1、PC-9shRNA-FoxM1)细胞株均表现稳定的FoxM1高表达及低表达特性。与相应的对照细胞株比较,H292FoxM1、PC-9FoxM1细胞株的细胞迁移、侵袭能力显著增强,肺癌细胞EMT相关标志物E-cadherin、ZO-1的表达明显降低,N-cadherin和Vimentin的表达显著增加(p<0.05)。FoxM1下调后,H1299shRNA-FoxM1、PC-9shRNA-FoxM1细胞株肺癌细胞的迁移及侵袭能力显著降低(p<0.05)。裸鼠体内肺转移模型中,高表达FoxM1显著促进PC-9细胞在裸鼠体内肺转移瘤形成和肺癌细胞的侵袭和分布。结论：FoxM1表达增加促进肺癌细胞的侵袭及迁移,上皮-间叶细胞转化可能是该机制中的关键环节。第三部分FoxM1参与肺癌细胞靶向治疗耐药的实验及机制研究[摘要]目的：通过构建FoxM1稳定过表达和稳定干扰肺癌细胞株,观察吉非替尼处理后其生存率和凋亡率的变化,探讨FoxM1是否参与了非小细胞肺癌细胞对吉非替尼耐药。方法：利用第二部分建立好的高表达FoxM1质粒,慢病毒感染H292(对吉非替尼敏感)肺癌细胞株,建立稳定高表达FoxM1的H292细胞株(H292FoxM1)；利用小干扰RNA技术在对吉非替尼耐药细胞株SPC-A-1中构建低表达FoxM1的SPC-A-1肺癌细胞株(SPC-A-1shRNA-FoxM1)。分别用1μM或1和10μM吉非替尼处理H292或SPC-A-1细胞株24、48和72小时,检测各细胞株的FoxM1表达变化。分别用0.1-20μM不同浓度吉非替尼处理SPC-A-1shRNA-FoxM1和H292FoxM1,利用流式细胞技术和MTT法检测各细胞株的细胞生存率和凋亡率。用westernblot方法检测SPC-A-1shRNA-FoxMl和H292FoxMl中FoxMl下游调节因子AuroraBkinase,Skp2,PLK1,CDC25B,survivin和cyclinB1等表达的变化。结果：1μM浓度吉非替尼处理敏感细胞株H292后,细胞中FoxM1表达明显下降；1和10μM浓度吉非替尼处理耐药细胞株SPC-A-1后,细胞中FoxMl表达明显升高,并呈时间、浓度依赖性。与对照细胞株相比,0.25、0.5、1、2、4μM浓度吉非替尼孵育的H292FoxM1细胞株细胞生存率明显升高,1和2μM浓度吉非替尼处理的H292FoxM1细胞株细胞凋亡率明显下降；0.1、1、5、10、20μM浓度吉非替尼孵育的SPC-A-1shRNA-FoxMl细胞株细胞生存率明显下降,1和10μM浓度吉非替尼处理的SPC-A-1shRNA-FoxMl细胞株细胞凋亡率明显升高(p<0.05)。FoxM1下游调节因子AuroraBkinase,Skp2,PLK1,CDC25B,survivin和cyclinB1的在H292FoxM1细胞株中表达上升,在SPC-A-1shRNA-FoxMl细胞株中表达下降。结论：FoxMl参与非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的耐药。抑制FoxMl的表达可以使肺癌细胞对吉非替尼增敏。
【作者】许诺；
【导师】白春学；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2012，博士
【关键词】非小细胞肺癌；FoxM1；临床预后；转移；肺癌；上皮-间叶细胞转化(Epithelial-MesenchymalTransition,EMT)；吉非替尼；耐药；

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